酶稳定性更高：2)可重复使用

固定化生物技术是氨基使水溶性的细胞/酶与水不溶载体在物理或化学方法的作用下成为水不溶性细胞/酶的一类技术。酶同定化技术是甲酸降解究用同体材料将游离的酶束缚或限制于一定区域，但仍具有催化活性并可重复使用的乙酯一种技术，其优点是固定：1)与游离酶相比，酶稳定性更高：2)可重复使用，化研节约资源；3)易于从目标物巾实现分离；4)酶活性保留时问长：5)环保，氨基对产物的甲酸降解究影响较小。但也存在以下几点不足：对同定化技术要求高，乙酯增加成本；制备过程酶活受影响：固定化酶的固定效果受多种因素影响因而存在较大差异。

自1910年酶的化研固定化研究开始，酶的氨基固定化技术也得到了很好的发展，尤其是甲酸降解究酶的固定化新型载体层出不穷。人们常根据不同的乙酯应用需求选择不同的同定化载体，不仅要求它的固定同定化性能好。比如食品领域就要求高安全性能、化研无污染性、经济实用性等。根据固定化载体的组成成分可将其基本分为以下3大类：无机载体(硅藻土、活性炭、多孔陶瓷、玻璃等、天然高分子材料(壳聚糖、淀粉、海藻酸钠、纤维素等和合成有机材料(常见的有聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、氧化石墨烯等。依据酶与载体的结合方式可将酶的固定化方法分为4类：吸附法是依靠带电的酶与载体之问的静电作用，使酶吸附于载体表面上的一种方法。包埋法是将酶用物理的方法包埋在各种载体(网格或半透膜)内，此法是目前应用最多的一种理想的固定化方法。交联法是借助双功能试剂使酶分子和载体之间发生交联的一种固定化方法.此法固定的酶具有良好的稳定性，常用的双功能试剂有戊二醛、甲醛、京尼平、双偶氮苯等。共价偶联法是借助共价键将载体的功能基团(芳香氨基、羟基、羧甲基等)和酶的活性非必需侧链基团(羧基、巯基、羟基、酚羟基和咪唑基等)进行偶联的一种方法。

在已有的报道中对固定化酶有如下研究：彭虹旎等以氨基多糖为材料，戊二醛为交联剂制备了表面光滑氨基多糖微球载体和多孔氨基多糖微球载体。以此载体对脲酶进行固定化，结果表明：多孔微球载体的同定化效率和同定化酶活力均高于表面光滑微球载体，因其固定的酶量更多，故表现出更高的酶活力。2015年，王简之等使用磁性复合微球对脂肪酶进行固定化，得到的固定化脂肪酶在热稳定性、酸碱耐受性、重复使用率方面有所提升。在pH4.0，共价固定6h后，固定化脂肪酶的酶活损失低于40％。有研究者将甲基丙烯、问苯二胺水凝胶、壳聚糖和氧化石墨烯反应制备复合材料，制得的复合凝胶在机械强度和吸附能力方面都有所提升。

凝胶在机械强度和吸附能力方面都有所提升。同定化酶在提高食品利用率和营养价值方面有突出贡献，比如固定化淀粉酶可以将淀粉分解为易被人体吸收的短链小分子糖：固定化脂肪酶可用于代可可脂的脱脂；而研究较多的固定化脲酶已应用于酒精饮料中尿素和EC的去除，可以提升发酵饮品的饮用安全性。为了充分发挥脲酶的实用价值，国内外研究者已对脲酶的同定化进行了不少探索，而直到近几年，国内学者才逐渐展开对EC降解酶的固定化研究。赵雅敏对筛选到的产EC降解酶的菌株LBMAE-8进行研究，发现对该菌进行细胞固定化处理，壳聚糖/海藻酸钙微胶囊一步法比海藻酸钙包埋法制得的固定化细胞的酶活回收率高。张迁等将来自P.rettgeriJN-B815的酸性脲酶经乙醇沉淀、离子交换等纯化后用壳聚糖微球进行固定化，制备的固定化酸性脲酶的温度稳定性、pH稳定性及对黄酒中尿素和EC的去除率均有所提升俐。刘小锋使用氧化石墨烯(GO)和壳聚糖(CS)复合微球对酸性脲酶进行固定化，在流化床反应器中考察同定化酸性脲酶对黄酒的处理效果，该酶对黄酒中尿素的去除率高达93.85％，而对EC的去除率达到57.46％。

固定化酶的酶活力、底物亲和力、米氏常数、反应活化能等性质会由于酶的性质、载体材料的性质及包埋条件的不同而发生改变，因此，一般对载体材料和同定化方法经过实验摸索才能确定最佳方案。通过筛选产EC降解酶的微生物并优化其产酶条件，从而获得一定数量的EC降解酶并将其应用于国内酒精饮料中EC含量的降低成为目前研究的一个热点。

作者同绕固定化EC降解酶的固定条件、酶学性质及应用展开研究，为保障发酵饮品的安全性提供理论支持。

1 材料与方式

1.1 材料与试剂

选取经活化和优化培养的CAT-4(Kluyvero-mycesmarxianus)酵母菌株作为出发菌株，取其发酵液通过反复冻融结合超声破碎法得到EC降解酶粗酶液，待用。乙醇(色谱纯)：天津致远公司产品；氨基甲酸乙酯、正丙基甲酸酯：Sigma-aldrich公司产品：其余溶剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DVB/CAR/PDMS(50/30pom)SPME萃取头、7890B-5977A气相色谱质谱联用仪：美国Agilent公司产品：FRESCO21高速冷冻离心机：ThermoFisherScientific公司产品：AS-4S超声细胞破碎仪：宁波新芝生物技术股份有限公司产品；722型可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 微球载体的制备及交联条件的优化

1) 滴入法制备壳聚糖微球

称取0.5g壳聚糖溶解于50mL体积分数1.0％的醋酸溶液中，置于摇床上活化2h，将活化的壳聚糖用注射器逐滴加入含有质量分数20％NaOH和体积分数30％CH3OH的凝结液中，挑选出粒度均匀、形状规整的壳聚糖微球，用去离子水洗至中性，冷藏备用。

2) 戊二醛交联壳聚糖载体的制备

将上述制备的微球置于体积分数6％戊二醛溶液巾，在30℃恒温水浴锅巾振荡6h。反应完成后，用去离子水反复洗涤，以去除剩余的戊二醛，直至洗涤液在280nm处的吸光度小于0.01，即得戊二醛交联壳聚糖微球载体。

3) 粗酶液的制备及EC降解酶的固定化

取一定量戊二醛交联壳聚糖微球载体，加入适量CAT-4菌株产生的粗酶液，置于30℃恒温水浴摇床上振荡1h。分离弃去上层溶液，用去离子水反复洗涤沉淀物，得到后续实验所用的同定化EC降解酶。

4) 戊二醛体积分数对载体制备的影响

配制体积分数2％、3％、4％、5％、6％和7％的戊二醛溶液，用注射器将冷藏的壳聚糖微球缓慢滴加至不同体积分数的戊二醛溶液巾，使其形成直径均匀的微球，在30℃恒温水浴锅中振荡6h。反应结束后，用去离子水反复洗涤，直至洗涤液在280nm处的吸光度小于0.01，即得戊二醛交联壳聚糖微球载体，置于4℃冰箱保存。用羟胺法[27]测其悬挂醛基质量分数。

5) 戊二醛交联时间对载体制备的影响

用注射器将冷藏的壳聚糖微球缓慢滴加至体积分数为6％的戊二醛溶液中，使其形成形状规整、均匀的微球，在30oC恒温水浴锅中振荡2、4、6、8、10h。其余操作同1.3.1中4)。

1.3.2 酶活力的测定

分别将1mL粗酶液或1g固定化EC降解酶和超纯水加到2支装有1mL质量分数3％EC溶液的10mL比色管巾，将比色管置于37℃水浴锅中反应15min后加入1mL终止剂，充分混匀后依次加入各1mL的显色剂I和显色剂Ⅱ,强烈振荡后继续置于37。C水浴条件下保温20min，用超纯水定容至刻度线，测定并记录A_625nm值。酶活计算公式如下：

式中：M为酶活力；△A_625nm为反应结束后空白对照与样品测定的光密度值之差：n为待测样液的稀释倍数：k为NH₄⁺标准曲线中斜率的倒数。

1.3.3 EC去除率的测定

1) 相图的制作

参考文献使用浊度滴定法测定双水相体系的二元曲线。具体做法如下：将乙醇逐滴加入盛有已知浓度K₂HPO。溶液的玻璃容器中，直到在25℃时形成界限清晰的两相体系。记录此时乙醇和K₂HPO₄组成。在此基础上，将去离子水滴加到玻璃容器中，得到一个清晰的单相体系，继续滴加乙醇，再形成两相体系，如此反复。接着用不同质量浓度的K₂HPO₄重复上述步骤，记录数据。

2) 乙醇和K₂HPO₄双水相体系(ATPS)

提取“美乐”葡萄酒中EC图1显示了用乙醇和K₂HPO₄双水相体系提取EC的原理。以含50μg/LEC和100μg/L正丙基甲酸酯(PC)的体积分数55％乙醇溶液作为模型溶液，用酒石酸和NaOH调节pH并记录当前的pH。

量取5mL模型溶液和过量的K₂HPO₄固体加人离心管中，混匀后以4000r/min离心5min，以确保两相完全分离。将离心管置于25℃恒温水浴中持续3.5h达到相平衡。记录顶相体积并取1.5mL的顶部溶液与150mg无水硫酸镁完全混合，在转速为12000r/min的条件下离心1min。最后，将1mL上清液通过0.45μm膜过滤，用于GC-MS分析。

3) EC的GC-MS检测

使用Agilent7890BGC-5977AMS系统进行EC的定量和定性分析。气相色谱柱为Carbowax20M(30m×0.25μm×0.25mm)，以氦气为载气，流量为1.0mL/min，进样口温度200℃，检测器温度250℃。柱温采用程序升温：初始温度50℃保留1min，以3℃/min升至180℃保留1min，然后以20℃/min升至220℃，保留10min。

质谱条件：以氦气为载气.采用电子轰击源(EI)的电离模式，电子能量70eV；四级杆温度150℃；离子源温度230℃；选取离子监测(SIM)模式，选择质荷比(m/z)分别为62、74和89作EC的监测离子，m/z为62作定量离子：选择m/z分别为59、62和89来监测PC，m/z为62作定量离子。

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